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本文由伯小远翻译自Bio-protocol。Bio-protocol是为一线科研人员服务的期刊，其专精于遴选、宣布从根底到高档，从传统到立异的各种试验计划。

摘要

烟草（N.benthamiana）是一个用于高水平、瞬时表达蛋白的杰出体系。本protocol详细描述了如安在烟草叶片中瞬时表达蛋白和完结免疫共沉积（Co-IP）试验，适用于蛋白纯化、研讨蛋白-蛋白相互作用以及其他蛋白相关试验。

资料和试剂

1.烟草种子

2.已转入双元载体（如pCAMBIA1300、pBIN19等，靶基因带有蛋白标签，本文以3×FLAG标签作为比如）的农杆菌菌株

3.乙酰丁香酮（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）

4.MES（pH5.6）（Sigma-Aldrich，目录号：M8250）

5.蛋白酶抑制剂（Roche，目录号：04693132001）

6.NP-40（Fluka，目录号：74385）

7.诱导培育基（见配方）

8.侵染培育液（见配方）

9.提取缓冲液（见配方）

10.TBS（见配方）

11.4×SDS（见配方）

设备

1.Anti-FLAG珠（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）

2.3×FLAG多肽（Sigma-Aldrich，目录号：F3290）

3.蛋白G琼脂糖珠（GE，目录号：17-0618-01）

4.用于农杆菌培育的试管、摇床等

5.离心机

6.1mL打针器

过程

1.选取生善于22℃（16h光照/8h漆黑）四周龄左右的烟草。将已转入双元载体（意图基因与3×FLAG标签相连）的农杆菌菌株，在3mL含有相应抗生素的LB液体培育基中28℃、200rpm过夜培育。

2.预备诱导培育基，将LB培育基中的农杆菌接种到诱导培育基中（过夜培育物按1/100稀释，或许培育8h的培育物按1/25稀释）。可在早上预备好后当晚进行侵染，或在晚上预备好后第二天早上做侵染。

3.28℃、200rpm培育8-12h使农杆菌细胞处于对数成长期，OD=0.6-0.8。

4.将农杆菌培育物在50mL离心管中以3200×g的速度离心10min。

5.预备好侵染培育液。

6.在5-10mL的侵染培育液中重悬农杆菌沉积。

7.使农杆菌重悬液的OD=0.1-0.3，每片叶子预备1mL重悬液即可。假如你想表达两种及以上蛋白，将每种农杆菌调好OD后混合即可。关于不同的质粒，引荐先进行预试验，经过调理OD值来操控蛋白的表达量，例如用更高OD的农杆菌来表达低丰度蛋白，用更低OD的农杆菌来表达高丰度的蛋白。

8.打针前30min，对烟草植株洒水，这样能够更简单进行打针。

9.挑选适宜的叶片进行打针。挑选外观健康的叶片，不要运用破损的叶片。抱负的叶片是嫩叶，3-5cm宽，每株运用2-3片叶片。每个叶片大约0.1g，满足检测蛋白含量了。关于Co-IP试验来说，10片叶片满足了。

10.涡旋农杆菌菌液使其悬浮，运用去掉针头的1mL打针器将农杆菌菌液打针至叶片的反面，打针时动作尽量轻柔，勿损害叶片。侵染区域能够很简单辨别出来，由于其会被水渗透。假如用力推动打针器但侵染区域中止扩展，那就换个区域持续打针，只需能掩盖整个叶片即可。对侵染区域的数量并没有特殊要求，但一般每片叶子少于5个。侵染完毕后，将植株放置于原成长环境下进行培育。

11.培育36-48h后，摘取被侵染的烟草叶片。1g鲜样一般满足。假如需求检测哪个时刻点表达的蛋白含量最高，则需求进行试验确认。

12.放入研钵，用液氮研磨样品。

13.向研钵中参加提取缓冲液（见配方，2%PVPP10mMDTT1×PI1mMPMSF），每克安排加约2mL提取缓冲液，放入4℃冰箱，比及粉末开端消融，并经过研磨使混合物均质。

14.将13步中的混合物转移至1.5mLEp管中，以最高速、4℃离心10min。

15.将上清液转移至新的Ep管中，并再次离心。

16.将上清液转移至新的Ep管中，参加20%NP40至终浓度为0.15%。

17.将20μL蛋白G琼脂糖珠参加样品中，在冷室中孵育30min（珠子运用1mL提取缓冲液进行预平衡，并在12,000×g离心30s后弃上清）。

18.经过12,000×g离心30s将珠子沉积，并将上清液转移到新管中。取60μL上清作为Input样品，作为对照，表明免疫沉积前的样品。

19.在上清液中参加10μLanti-FLAG珠。珠子也需求平衡，同过程17，4°C孵育3h。

20.离心沉积珠子，取60μL上清液作为试验样品。

21.用1mL提取缓冲液（含0.15%NP40）清洗珠子3次。清洗过程是：参加1mL提取缓冲液，4°C、12,000×g离心1min来沉积珠子，丢掉上清液。

22.再参加100μL稀释的3×FLAG多肽，冷室孵育1h（在含有1mMEDTA和1×蛋白酶抑制剂的TBS中稀释3×FLAG贮存液至1/10的浓度。溶解于TBS的2.5mg/mL3×FLAG贮存液可在-20°C下贮存多年）。

23.离心以沉积珠子，将上清液转移至洁净的Ep管中。向上清液中参加35μL4×SDS上样缓冲液。该部分是含有纯化后的免疫沉积蛋白的洗脱样品。将60μL1×SDS上样缓冲液参加含有珠子的Ep管中。珠子或许含有无法洗脱的残留蛋白质。

24.在Input组和试验组样品中参加恰当体积的4×SDS加载缓冲液。将一切样品在95-100°C下煮沸5-10min。并运用蛋白质印迹剖析样品。

数据

以下为一个典型的Co-IP试验成果图。

图1Co-IP检测bHLH84-HA与SNC1-FLAG的相互作用(Xuetal.,2014)。

注：

1.在Co-IP试验中必须有阴性对照。关于单个的蛋白质免疫沉积，以表达空载体作为阴性对照。关于两种或多种蛋白的免疫共沉积，主张将不含钓饵蛋白的空载与含有猎物蛋白的相关载体一同表达。依据不同的试验设计，能够包含更多的阴性对照。

2.虽然IP的功率在不同的试验中或许略有不同，只需蛋白被拉下，免疫沉积试验就具有高度的可重复性。

配方

1.诱导培育基

2.侵染培育液

3.提取缓冲液

10%甘油

25mMTris-HCl1mMEDTA

150mMNaCl

4.TBS

10mMTris-HCl

150mMNaCl（pH7.4）

5.4×SDS

200mMTris-HCl（pH6.8）

8%SDS

40%甘油

0.04%溴酚蓝

400mMDTT

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Co-IP（用于验证蛋白-蛋白相互作用）

IP-MS（用于寻觅已知蛋白和不知道蛋白的相互作用）

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References：

Moffett,P.,Farnham,G.,Peart,J.andBaulcombe,D.C.(2002).InteractionbetweendomainsofaplantNBS-LRRproteinindiseaseresistance-relatedcelldeath.EMBOJ21(17):4511-4519.

VandenAckerveken,G.,Marois,E.andBonas,U.(1996).RecognitionofthebacterialavirulenceproteinAvrBs3occursinsidethehostplantcell.Cell87(7):1307-1316.

Xu,F.,Kapos,P.,Cheng,Y.T.,Li,M.,Zhang,Y.andLi,X.(2014).NLR-associatingtranscriptionfactorbHLH84anditsparalogsfunctionredundantlyinplantimmunity.PLoSPathog10(8):e1004312.